用于诊断癌症的液体活组织检查

通常，使用组织活检来检查肿瘤。从肿瘤中取出一小部分样本并进行基因分型，或分析基因组成。这种方法的问题在于活检肿瘤可能具有挑战性。此外，肿瘤活组织检查仅提供肿瘤的快照。

写作 发现医学 2015年，Labgaa及其合作者就常规肿瘤活检进行了如下陈述：

“由于显而易见的原因，很难通过连续活检来监测肿瘤的进展。而且，活组织检查仅反映肿瘤的单个部位，因此不太可能代表大肿瘤中的整个体细胞突变。另一种方法是获得多个肿瘤。对同一肿瘤进行活组织检查，但这种选择既不现实也不准确。“

液体活组织检查涉及测量从癌症患者获得的血液样品中的循环DNA（ctDNA）和其他肿瘤副产物。这种新兴的诊断方法有望快速，无创且具有成本效益。

液体活检的历史

1948年，Mandel和Métais，一对法国研究人员首先在健康人的血液中发现了ctDNA。这一发现超前于它的时代，直到几十年后才进一步探索ctDNA。

1977年，Leon及其同事首次发现癌症患者血液中ctDNA含量增加。到1989年，Stroun及其同事确定了血液中的肿瘤（即癌症）特征。在这些发现之后，其他几个小组发现了肿瘤抑制因子和癌基因，微卫星不稳定性和DNA甲基化的特异性突变，这证明了ctDNA被肿瘤释放到循环中。

虽然我们知道源自肿瘤细胞的ctDNA在血液中循环，但这种DNA的起源，释放速率和释放机制尚不清楚，研究结果相互矛盾。一些研究表明，更多的恶性肿瘤含有更多死亡的癌细胞并释放出更多的ctDNA。然而，一些研究表明所有细胞都释放ctDNA。尽管如此，癌症肿瘤似乎可能会释放ctDNA水平进入血液，使ctDNA成为癌症的良好生物标志物。

由于血液中碎片较多且浓度较低，ctDNA难以分离和分析。血清和血浆样品之间的ctDNA浓度存在差异。似乎血清而不是血浆是更好的ctDNA来源。在Umetani及其同事的一项研究中，发现血清中ctDNA浓度始终低于血清，因为在纯化过程中可能会丢失循环DNA，因为凝固和其他蛋白质在样本制备过程中被消除。

根据Heitzer及其同事的说法，这里有一些需要解决的具体问题，以利用ctDNA的诊断潜力：

“首先，分析前程序需要标准化……选择一种确保提取足够量的高质量DNA的分离方法至关重要，并且已经证明血液采样和加工的分析前因素可以强烈影响DNA产量。其次，最重要的问题之一是缺乏量化方法的协调。不同的量化方法，…产生不同的结果，因为这些测量针对的是总DNA或只有可扩增的DNA ……第三，对起源和详细的了解较少ctDNA释放的机制，并且在大多数研究中混淆了可能也有助于释放ctDNA的事件。“

目标与非目标方法

目前，在分析血浆（或血清）的ctDNA时，有两种主要方法。第一种方法是针对性的，并寻找指示肿瘤的特定遗传变化。第二种方法是非靶向的，涉及全基因组分析，寻找反映癌症的ctDNA。或者，外显子组测序已被用作更具成本效益，无目标的方法。外显子组是转录成蛋白质的DNA部分。

通过靶向方法，在一小组驱动突变中分析血清的已知基因突变。驱动突变是指基因组中促进或“驱动”癌细胞生长的突变。这些突变包括 KRAS 要么 EGFR.

由于近年来的技术进步，用于分析少量ctDNA的基因组的靶向方法已经变得可行。这些技术包括ARMS（扩增难治性突变系统）;数字PCR（dPCR）;珠子，乳液，扩增和磁性（BEAMing）;和深度测序（CAPP-Seq）。

尽管已有技术进步使得有针对性的方法成为可能，但目标方法仅针对突变（热点）的一些位置并且错过许多驱动突变，例如肿瘤抑制基因。

非靶向液体活检方法的主要好处是它们可以用于所有患者，因为该检测不依赖于反复发生的遗传变化。经常性遗传变化不包括所有癌症，也不是特定的癌症特征。然而，这种方法缺乏分析敏感性，并且尚无法对肿瘤基因组进行全面分析。

值得注意的是，整个基因组测序的价格已大幅下降。 2006年，全基因组测序的价格约为300,000美元。到2017年，每个基因组的成本降至约1,000美元（美元），包括试剂和测序机器的摊销。

液体活检的临床应用

最初使用ctDNA的努力是诊断性的，并且比较了健康患者与癌症患者或良性疾病患者的水平。这些努力的结果是混合的，只有一些研究表明显着的差异表明癌症，无疾病状态或复发。

ctDNA只能在某些时候用于诊断癌症的原因是因为可变量的ctDNA来源于肿瘤。并非所有肿瘤都以相同的量“脱落”DNA。一般而言，更先进，更广泛的肿瘤比早期局部肿瘤更多的DNA进入循环。另外，不同的肿瘤类型将不同量的DNA释放到循环中。来自肿瘤的循环DNA部分在研究和癌症类型中变化很大，范围从0.01％到93％。值得注意的是，一般来说，只有少数ctDNA来自肿瘤，其余部分来自正常组织。

循环DNA可用作疾病的预后标志物。循环DNA可用于监测癌症随时间的变化。例如，一项研究显示结直肠癌患者的两年存活率（即结肠直肠癌确诊后至少两年仍存活的患者人数）和 KRAS 没有相应循环DNA证据的热点突变率为100％。此外，有可能在不久的将来，循环DNA可用于监测癌前病变。

循环DNA也可用于监测对治疗的反应。因为循环DNA提供了更好的肿瘤基因组成的整体图像，这种DNA可能包含诊断DNA，可用于代替从肿瘤本身获得的诊断DNA。

现在，让我们来看一些液体活检的具体例子。

Guardant360

Guardant Health开发了一项测试，该测试使用新一代测序技术来分析73种癌症相关基因的突变和染色体重排的循环DNA。 Guardant Health发表了一项研究报告了液体活检在肿瘤学中的应用。该研究使用了来自15,000名患者的血液样本，这些患者共有50种肿瘤类型。

在大多数情况下，液体活检测试的结果与肿瘤活组织检查中观察到的基因改变一致。

据美国国立卫生研究院称：

“Guardant360在重要的癌症相关基因中发现了相同的关键突变 EGFR，BRAF， KRAS ，和 PIK3CA 频率与先前在肿瘤活检样本中发现的频率非常相似，在统计学上与94％至99％相关。“

此外，根据NIH，研究人员报告了以下内容：

“在该研究的第二部分中，研究人员评估了将近400名患者 - 其中大多数患有肺癌或结肠直肠癌 - 同时具有血液ctDNA和肿瘤组织DNA结果，并比较了基因组变化的模式。液体的整体准确性与肿瘤活检分析结果相比，活组织检查结果为87％，当血液和肿瘤样本在6个月内收集时，准确率提高到98％。

即使血液中循环DNA的水平很低，Guardant360也是准确的。通常，循环肿瘤DNA仅占血液中DNA的0.4％。

总体而言，使用液体活检，护卫队的研究人员能够识别出可以指导67％患者的医生治疗的肿瘤标志物。这些患者有资格获得FDA批准的治疗以及研究性治疗。

ctDNA和肺癌

2016年，FDA批准cobas EGFR突变试验用于检测 EGFR 肺癌患者循环DNA突变。该试验是FDA批准的第一次液体活检，并确定了可能是使用厄洛替尼（特罗凯），阿法替尼（Gilotrif）和吉非替尼（易瑞沙）作为一线治疗和osimeritinib（Tagrisso）作为靶向治疗的候选药物的患者。二线治疗。这些靶向治疗特异性地攻击癌细胞 EGFR 突变。

重要的是，由于大量的假阴性结果，FDA建议组织活检样本也取自液体活检阴性的患者。

ctDNA和肝癌

在过去的20年中，死于肝癌的人数有所增加。目前，肝癌是世界上癌症死亡的第二大原因。没有可用于检测和分析肝癌或肝细胞癌（HCC）癌症的良好生物标志物。循环DNA可能是肝癌的良好生物标志物。

考虑以下来自Lagbaa和共同作者的关于使用循环DNA诊断肝癌的可能性的引用：

“RASSF1A，p15和p16的高甲基化已被建议作为包括50名HCC患者在内的回顾性研究中的早期诊断工具。还检测了四种异常甲基化基因（APC，GSTP1，RASSF1A和SFRP1）的特征，同时测试其诊断准确性， RASSF1A的甲基化被报道为预后生物标志物。随后的研究使用深度测序技术分析了HCC患者的ctDNA ….引人注目的是，在血液采集时没有HCC史的两个HBV携带者中检测到异常DNA拷贝数，但是他们在随访期间发展了HCC。这一发现为评估ctDNA中的拷贝数变异作为早期HCC检测的筛选工具打开了大门。“

来自DipHealth的一句话

液体活组织检查是基因组诊断的一种令人兴奋的新方法。目前，医生可以获得某些提供全面分子谱分析的液体活组织检查，以补充从组织活检中获得的遗传信息。当组织活组织检查不可用时，还可以使用某些液体活组织检查来代替组织活检。

重要的是要记住，目前正在进行许多液体活检试验，需要进行更多研究以充实这种干预的治疗效用。